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PCR反應(yīng)實驗步驟及反應(yīng)擴(kuò)增問題情況分析

一、PCR反應(yīng)完整實驗步驟

試劑準(zhǔn)備?

所有試劑提前解凍，全程冰上操作，低速離心后使用。

按體系比例依次加入水、緩沖液、dNTPs、引物、模板DNA和Taq酶，常規(guī)體系為20-50微升。

分區(qū)操作，先在試劑區(qū)加完除模板外的組分，再移至模板區(qū)加入DNA，避免交叉污染。

溫度循環(huán)設(shè)置?

預(yù)變性：94-98℃加熱1-5分鐘，讓模板DNA雙鏈充分解開。

循環(huán)擴(kuò)增：重復(fù)25-40個循環(huán)，每輪依次為95℃變性30秒、50-65℃退火30秒、72℃延伸1分鐘。

終延伸：最后72℃保溫5-10分鐘，確保所有擴(kuò)增產(chǎn)物合成完整，結(jié)束后4℃暫存。

產(chǎn)物檢測?

配制1%左右的瓊脂糖凝膠，將擴(kuò)增產(chǎn)物與DNA Marker依次點樣，120V電泳30分鐘。

紫外成像儀下觀察條帶，判斷是否得到目標(biāo)大小的擴(kuò)增片段。

二、常見擴(kuò)增問題情況分析

無擴(kuò)增條帶?

模板問題：模板中雜蛋白殘留、核酸降解或濃度過高/過低，需重新純化模板并調(diào)整用量。

試劑問題：Taq酶失活、引物降解或dNTPs失效，更換新批次試劑重新配制體系。

程序問題：預(yù)變性不充分、退火溫度過高導(dǎo)致引物無法結(jié)合，適當(dāng)延長預(yù)變性時間、降低退火溫度。

非特異性擴(kuò)增/條帶雜?

引物問題：引物設(shè)計不合理、存在非特異性互補序列，重新設(shè)計引物并優(yōu)化濃度。

程序問題：退火溫度過低、循環(huán)次數(shù)過多，適當(dāng)提高退火溫度、減少2-3個循環(huán)。

體系問題：酶用量過大，按說明書減半調(diào)整酶的加入量。

出現(xiàn)引物二聚體?

引物濃度過高，將上下游引物終濃度調(diào)整至0.1-0.3μM。

引物之間存在互補序列，重新設(shè)計引物避免3'端互補配對。

可使用熱啟動Taq酶，減少低溫下引物的非特異性結(jié)合。

循環(huán)次數(shù)過多導(dǎo)致產(chǎn)物過量降解，減少循環(huán)次數(shù)。

電泳條件不合適，調(diào)整電泳電壓不超過150V，控制電泳時間。

注：以上科研產(chǎn)品資料僅供參考！

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